Distinction Identification among Four Flammulina velutipes Mitochondrial Sequences based on whole Genome Resequencing

Lü Xiaomeng　Wang Xiangfeng　Zhang Dawei　Wang Qingji　Wang Wei^*

College of Plant Protection of Shandong Agricultural University, Shandong Provincial Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Tai’an, 271018

^*Corresponding author, uniwangwei@sdau.edu.cn

Abstract　In eukaryotic cells, mitochondria are the sites of oxidative phosphorylation. It is widely present in organisms and has independent genetic material DNA, can participate in cytoplasmic inheritance. At present, the mitochondrial genome of Flammulina velutipes has been analyzed, but its polymorphism in different strains has not been reported yet. In this study, we assembled and annotated the mitochondrial sequences of three F. velutipes (6-3, 6-21, L22) in combination with the published mitochondrial genome of F. velutipes 4019-20. The comparative analysis of genomes showed that the mitochondrial genome length of F. velutipes was between 87 646~88 508 bp, the number of encoded proteins is 15, the number of encoded tR-NA is 26, and the gene encoding rRNA large and small subunits is 1 in each. All strains contained 10 introns except 4019-20, which contained 9 introns. Further synteny of the mitochondrial genome structure of the four F. velutipes strains showed that there were four different fragments among the four strains, among which the different fragment I was the 4th intron of COX1 gene (absent in strain 4019-20). Meanwhile, we also detected two translocation fragments in F. velutipes mitochondrial genome, and there were ~ 1.6kbp and ~ 2.8kbp polymorphisms at the translocation sites. The results of this study can provide a certain data basis for the study of the mitochondrial genome structure and genetic characteristics of F. velutipes.

Keywords　Flammulina velutipes; Mitochondria; Different segments; Genomic structure

线粒体是细胞中进行有氧呼吸的主要场所，为生物体的生命活动提供ATP。线粒体是一种半自主性细胞器，自身具有遗传物质DNA和蛋白质表达系统。在一定条件下，线粒体基因能够转移到核基因组中，某些线粒体基因也会由于核基因组包含有类似功能的基因而丢失(Adams and Palmer, 2003)。

由于新一代测序技术的不断发展，全基因组序列的解析更加简便，并且成本也有所降低。因此，许多线粒体组已经得到了测序(Brankovics et al., 2017; Yamasaki et al., 2017)。线粒体基因组具有体积相对较小、突变率高、子代是母性遗传且不发生DNA重组等优点，使得线粒体基因组成为种群遗传学和进化生物学研究的有力工具(Shen et al., 2015; Mumo et al., 2016; Jimenez et al., 2017)。真菌的线粒体基因组在基因组大小、重复、基因间区、内含子、开放阅读框(ORF)和基因顺序等方面有着显著差异(Zhang et al., 2017a; Zhang et al., 2017b)。真菌线粒体基因组(mtDNA)的大小从19 kb到121 kb不等，其进化速度往往快于核DNA。虽然真菌线粒体基因组在大小上有变化，但它们通常包括一组14个保守的蛋白编码基因、2个核糖体RNA基因和22~26个转移RNA基因(Kang et al., 2017; Yuan et al., 2017)。线粒体细胞色素c氧化酶1(COX1)和核糖体DNA (rDNA)序列已被用作DNA条形码，用于真菌的鉴定和分子进化的检测。

在真菌中，不同物种的线粒体基因组存在差异。虽然与氧化磷酸化相关的14个基因、2个rRNA基因和1个核糖体蛋白基因在亲缘关系较近的物种中具有较好的保守性。然而，不同物种间tRNA基因和预测的开放阅读框基因的数量存在一定差异，保守基因的顺序因不同的系统发育关系而不同。金针菇[Flammulina velutipes (Curt. ex Fr.) Sing]隶属于担子菌门，是一种能降解木质纤维素的白腐菌。它是一种具有保健和药用价值的真菌，并且在世界上，尤其是东亚地区广泛生产栽培，中国也具有丰富的金针菇种质资源。目前关于金针菇线粒体基因组的研究较少。第一个金针菇菌株KACC42780全基因组数据于2011年公布(van Peer et al., 2011; Park et al., 2014)。随之，菌株4019-20的线粒体基因组被解析，该菌株环形的mtDNA基因组大小为为88 508 bp，包括15个编码基因(含核糖体蛋白编码基因)、两个rRNA基因和26个tRNA基因(Yoon et al., 2012)。为解析不同金针菇线粒体结构差异，本研究测序组装了三株单核金针菇线粒体基因组，并结合已公布菌株4019-20线粒体基因组进行比较分析，以期为金针菇菌株鉴定与分子辅助育种提供参考。

1结果与分析

1.1线粒体基因组组装与注释

通过对四株菌株的线粒体基因组组装分析，金针菇线粒体基因组大小在87 646-88 508 bp之间。GC含量都比较低，4019-20菌株的为16.5%，其他3个菌株为16.7% (表1)。四株菌株线粒体基因组编码蛋白、tRNA和rRNA数目没有差异，但是菌株4019-20内含子个数缺失一个。线粒体图谱比较分析表明：四株菌株的线粒体基因组编码基因数量和顺序都具有较高的保守性(图1)。

图1 金针菇线粒体基因组图谱 Figure 1 Mitochondrial genome map of F. velutipes

表1 四株金针菇菌株线粒体基因组基本特征 Table 1 Basic parameters of four F. velutipes mitochondrial genomes

1.2线粒体基因组内含子概况

对四株金针菇mtDNA编码基因的内含子分析表明，菌株4019-20较其他三株菌株缺失第四个内含子(表2)。四株单核体菌株之间所含内含子的种类、长度和开放阅读框也存在部分差异。

表2 金针菇线粒体内含子概况 Table 2 Overview of mitochondrial introns in F. velutipes 注: *: 表示“无” Note: *: means “none”

1.3线粒体基因组差异片段鉴定

我们进一步在NCBI对四株金针菇线粒体差异片段进行了分析(图2)，经过与注释结果(表3)比对，发现4个差异片段均注释到了ORF。其中，差异片段Ⅰ可以编码GIY-YIG型归巢核酸内切酶，差异片段Ⅱ不能编码蛋白，差异片段III可以编码RNA聚合酶，差异片段Ⅳ也不能编码蛋白。

图2 四株金针菇线粒体基因组共线性比对 Figure 2 Synteny comparison of four F. velutipes mitochondrial genomes

表3 四株金针菇线粒体基因组差异片段注释 Table 3 Annotation on the different fragments of four Flammulina velutipes mitochondrial genomes 注: *: 表示“无” Note: *: means “none”

1.4移位片段鉴定

通过对四株金针菇线粒体基因组数据的共线性分析，我们还鉴定到在金针菇线粒体中存在着两个移位片段(~400 bp; ~600 bp)。菌株6-3、菌株6-21和菌株L22基因片段1和基因片段2所在的位置基本一致，但是菌株4019-20的基因片段1和基因片段2所在的位置同其他三株测序菌株的位置相比较发生了移位(图3, 表4)。

表4 位移片段注释 Table 4 Annotation of translocation fragments

图3 位移片段多态性对比 Figure 3 Polymorphisms of translocation fragments

2讨论

线粒体细胞器存在于大多数真核生物中(Karnkowska et al., 2016)。mtDNA的共同特征是A+T含量高、缺乏甲基化、基因功能保守、拷贝数高(Campbell et al., 1999)。随着高通量测序技术的快速发展，越来越多的真菌线粒体基因组被测序和表征。所报道的基因组通常包含一组相似的保守基因，包括14个蛋白编码基因(nad1, nad2, nad3, nad4, nad4L, nad5, nad6, atp6, atp8, atp9, cox1, cox2, cox3和cob)、一组tRNA以及大小核糖体RNA (rns和rnl)，某些真菌还含有核糖体蛋白S3 (rps3)。Sclerotinia borealis的mtDNA长203 051 bp是已知最大的真菌线粒体基因组之一，主要取决于可移动的遗传元素的存在，其中包括61个内含子(Mardanov et al., 2014)。内含子分布在12个蛋白质编码基因和核糖体RNA基因中，共125 394 bp。大多数内含子包含完整或截断的ORF，与LAGLIDADG和GIY-YIG家族的归巢内切酶有关(Mardanov et al., 2014)。真菌mtDNA中内含子的数量不等，至今为止尚未发现真菌线粒体基因中内含子具有物种特异性。通过研究发现，随着基因中内含子数量的减少，真菌线粒体基因组也随之变小。研究表明，真菌线粒体内含子的进化是复杂的，真菌线粒体基因组发生变化的重要原因可能是内含子的变化(Deng et al., 2018)。

目前，对于金针菇线粒体基因组的比较分析研究较少。本实验着重对4株金针菇线粒体基因组结构进行共线性分析，实验结果最终表明：在这4个不同的菌株中含有4个差异片段，其中差异片段I为cox1基因第4内含子(菌株4019-20缺失)。同时，我们还检测到金针菇线粒体基因组中有两个片段存在移位现象，在移位位点处存在~1.6 kbp和~2.8 kbp的多态性片段。这些差异片段的获得可为下一步开发分子标记用于金针菇菌株鉴定以及种质资源分析提供帮助。本研究对金针菇线粒体基因组结构差异进行了分析，也有助于对基于线粒体遗传特性的金针菇新品种选育。

3材料与方法

3.1供试菌株基因组数据

本研究共选用四株金针菇菌株的基因组序列进行分析。单核菌株4019-20线粒体基因组下载自GenBank，登录号为JN190940.1。重测序的单核菌株6-3、6-21和L22基因组数据均由福建省食用菌种质资源保藏与管理中心提供。

3.2线粒体基因组的组装

使用本地本地BLASTN同源搜索程序(E≤1e-5)，将6-3、6-21和L22菌株的全基因组序列与4019-20菌株线粒体基因组进行比对分析，分别筛选出各菌株的线粒体基因组片段(Scaffolds, Contigs和Nodes)。各菌株线粒体基因组长度、GC含量由DNAMAN软件进行计算分析。使用Mauve 软件对各菌株线粒体基因组进行共线性比对分析，校正各菌株线粒体基因组(Darling et al., 2004)。线粒体图谱采用在线程序CGView Server (http://stothard.afns.ualberta.ca/cg-view_server/)绘制。

3.3线粒体基因组的注释

分将四株金针菇线粒体基因组序列输入线粒体在线注释程序MFannot (http://megasun.bch.umontreal.ca/cgi-bin/mfannot/mfannotInterface.pl) (Genetic code: Yeast Mitochondrial)，对其进行注释。使用该程序能够对线粒体基因组的蛋白编码基因、rRNA、tRNA、内含子类型和ORF完成注释。对四株金针菇菌株的内含子类型、长度、内含子ORF进行统计，并将内含子序列使用BLASTX程序进行在线比对，分析其保守区域。

3.4移位片段分析

使用Mauve 软件共线性分析，对线粒体DNA上基因排列进行比较，筛选大于和等于500 bp的DNA差异片段，并对其注释结果进行分析(Darling et al., 2004)。使用BLASTX程序进行在线比对，分析差异片段可能的基因功能。同时，根据线性比对结果，鉴定移位片段的位置特征。

作者贡献

吕晓萌是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；王祥锋、张大伟、王庆佶参与实验设计和试验结果分析；王威是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(31902086)和山东省自然科学基金项目(ZR2018BC041)共同资助。

参考文献

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